鉴定新型冠状病毒

当你接触到像新型冠状病毒这样的致命病毒时,你必须迅速采取行动。自美国首次报告covid19感染以来的三个月里,该病毒已蔓延到除美属萨摩亚、密克罗尼西亚、帕劳和马绍尔群岛以外的所有50个州和美国领土。它造成了隔离、封锁、疾病和死亡,并给我们所知的生活带来了突然而重大的变化。

美国应对流感大流行的最大挫折之一是缺乏检测。COVID-19是迅速和隐秘的,通过人与人之间的接触以及通过受污染的表面传播。许多携带者没有症状,通常不知道他们无论走到哪里都在传播病毒。如果我们不知道谁拥有它,谁没有,它的路径怎么能被追踪,更不用说预测了。

加州大学圣巴巴拉分校(UC Santa Barbara)的分子生物学家马克斯·威尔逊(Max Wilson)说,缺乏检测的主要原因之一可能是在全世界范围内严重缺乏检测这种病毒所需的基本试剂。

“它们在全世界范围内都被耗尽了,”威尔逊说。几周前,他和他的同事向圣巴巴拉的家庭健康系统捐赠了600个“反应”,以帮助他们确定谁可能被感染。目前,圣巴巴拉县报告了477例,39例住院治疗和7例死于covid19感染,这是一个相对较低的感染率,可以归因于有效的社会距离。然而,实际的携带者数量很可能要高得多;目前,检测仅限于特别易受感染的个人,如老年人和那些可能曾去过冠状病毒疫区或与确诊的covid19患者有过接触并正在出现症状的人。

威尔逊和他的同事肯尼斯·s·科西克、迭戈·阿科斯塔-阿尔韦亚尔以及卡罗莱纳·阿里亚斯希望能帮助改变这种状况。他们开发了一种基于crispr的测试,该测试有望与传统测试一样敏感,但也更快,可在现场部署——这是当前测试方法所缺乏的品质。而且由于研究人员的CREST(基于cas13的、坚固的、公平的、可扩展的测试)测试是基于一种不同于传统PCR(聚合酶链反应)测试的方法,它不受目前试剂短缺的影响。

“我们已经大规模扩张了,”威尔逊说。“例如,我们已经提纯了足够的蛋白质,我们基于crispr的分析方法可以一次性完成50万个测试。”

研究人员的工作是在bioRxiv的预印本。

寻找病毒RNA

迄今为止最常见的测试新型冠状病毒和认可的疾病控制中心(CDC)——是一个实时PCR测试,在遗传物质(在这种情况下,单一链RNA)从样本中提取组织和转化成双螺旋DNA的暴露在一种酶逆转录酶。

“DNA要稳定得多,我们也更善于研究和检测它,”威尔逊说。将这些DNA链放在混合的试剂中,经过加热和冷却的循环,这些DNA链就会分离出来,成为“引物”分子,用来识别附着在基因组上的病毒遗传物质。然后,一种酶复制引物和荧光探针之间缺失的部分,发出完整复制的信号。现在DNA链的数量是以前的两倍,这个循环不断重复,直到出现数百万到数十亿的DNA链。样本中的荧光表明,该遗传物质已被识别为来自SARS-CoV-2病毒,并进行了复制,放大了信号。实时荧光定量PCR检测虽然敏感,但需要几天才能得到结果。

研究人员的实验以一种更直接的方式检测病毒。基于细菌Cas (CRISPR相关)蛋白寻找、发现和与遗传物质相互作用的CRISPR基因编辑技术,该方法利用这些蛋白的基因寻找能力来确定冠状病毒的基因组。

“一般来说,这些Cas蛋白被细菌用作一种免疫系统,”Wilson解释道。Cas9是与CRISPR联系最紧密的蛋白质,它被细菌用作一对可编程的“分子剪刀”,用来识别病毒的DNA序列并标记它们的破坏程度。

“但这种冠状病毒和其他病毒都有RNA基因组,而其他的Cas系统已经进化到可以识别RNA,”Wilson在谈到Cas13时表示,Cas13是这种应用的首选蛋白质。

当Cas13找到它的目标时,它将“变成一种非特异性的酶,可以降解任何RNA序列”,而不是切割特定的遗传物质序列。在微生物世界中,当病毒感染细菌时,细菌中的Cas13被激活,它通常会降解细菌的RNA,这有点类似于把自己扔向手榴弹。

威尔逊说:“实际上有人认为,细菌的‘自杀’是一种保护形式,可以帮助周围的细菌种群。”“这是自我隔离的最终形式。”

为了检测冠状病毒,研究人员编写了Cas13程序来识别病毒基因组的特定位置。“一旦它锁定这些位点并识别它们,这种酶就会变得活跃,”威尔逊说。当这种酶开始吞噬非特异性RNA时,荧光指标就会在研究人员的检测中发光。“当我们把这些东西混合在一起时,如果病毒存在,我们的小水井就会亮起来,”他说——不需要拖延,也不需要机器。

为了将其作为一种新型冠状病毒检测的新方法,CREST公司面临着与其他新兴冠状病毒检测同样的障碍:FDA的批准要求和疾病控制中心的认可。还有一个事实是,它是在研究实验室而不是在临床实验室开发的,这意味着根据隐私规则,受试者的身份不能与特定的结果联系起来。

“现在我们还不能把它用于诊断目的,”Wilson说,他和他的团队正处于推出试验的边缘。“我们正在评估潜在的需求和障碍。”

实际上,围绕COVID-19诊断方法的情况一直在变化:FDA一直在发布COVID-19诊断方法的紧急使用授权,以“扩大诊断测试的数量和种类”,因为主要制药公司正在加速共享资源和增加测试能力。

加州大学圣巴巴拉分校负责研究的副校长约瑟夫·因坎代拉说:“看来UCSB团队已经完成了黛博拉·比尔克斯博士本周早些时候提出的要求——一个测试上的突破。”“他们一边这样做,一边转向远程教学、在家照顾孩子,以及我们所面临的所有其他挑战。这是惊人的,我希望我们现在可以为了每个人的利益,快速通过FDA的审批。”

跟踪社区传输

不管怎样,有很多事情要做。研究人员希望将Cas13测试的能力最大化,并将其与疾病预防控制中心的测试进行比较,本质上是测试“黄金标准”。

研究小组成员Carolina Arias说:“我们已经证明CREST能够检测到每微升10个RNA拷贝。”她的研究重点是了解病毒与宿主之间的相互作用。

此外,研究人员正在进行一项监测研究,其中他们将收集来自一般社区的健康、无症状个体的样本,以了解热点在哪里、无症状感染的频率、可能为响应后勤提供信息的数据。他们还希望对每一个阳性检测的基因组进行排序,以寻找病毒在全球传播时可能产生的变异的线索——威尔逊说,这些信息可能会在寻找治疗或治愈方法的过程中被证明是有用的。

他们的发现将被发布在bioRxiv网站上,bioRxiv是一个生物科学的预印本服务器,研究人员可以在论文提交之前或提交期间立即获得他们的发现。

对于那些因为多次关闭命令而导致其个人研究“陷入停顿”的科学家来说——首先是来自校园,然后是来自国家——为了应对流感大流行,威尔逊等人非常忙碌。

“我早就为这个损失哀悼了,”威尔逊说。他在一年半前加入了生物学院,花了大量时间试图在流感大流行到来之前启动他的研究项目。“但我甚至不担心,因为这正是我们必须做的。”

另一方面,环境提供了一个独特的机会来见证最好的科学和科学家。

他说:“我把科学家们的努力看作是我们国家抗击这种疾病的骑兵。”“我完全被同事们的协作和创新水平震惊了,就在几周前,他们还在研究完全不同的东西。而现在,我们所有的covid19研究人员都在努力利用科学让这个国家重新站起来。”

该项目的研究也由来自UCSB分子、细胞和发育生物学部门的Jennifer Rauch、Eric Valois、Sabrina C. Solley、Friederike Braig、Ryan S. Lach和Naomi J. Baxter进行。

新闻旨在传播有益信息,英文原版地址:https://www.news.ucsb.edu/2020/019842/identifying-novel-coronavirus

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